Chromatographie

Für die moderne Proteomanalytik ist die Trennung von komplexen Peptidgemischen essentiell. Im Rahmen unserer Projekte erfolgt die Analyse durch die Kombination von hocheffizienter Probenauftrennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) und massenspektrometrischer Detektion. Zur Trennung von Biomolekülen aus komplexen Proben können verschiedene chromatographische Techniken wie z.B. Ionenaustausch, Affinität oder Reversed Phase (RP) verwendet werden. Dabei werden spezifische Eigenschaften wie Größe, Ladung oder Hydrophobizität genutzt, durch die eine reversible Interaktion zwischen dem Analyt und einer stationären Phase stattfindet. Standardmäßig werden in der Proteomanalytik RP-HPLC basierende Trennverfahren genutzt, bei denen die zu untersuchenden Peptide zusammen mit einem Lösungsmittel durch eine Trennsäule gepumpt werden, die die stationäre Phase enthält. Die aufgetrennten Peptide werden anschließend mit einem Massenspektrometer analysiert. Um eine bessere Abdeckung von Proteomen zu erreichen und zudem die Detektion von niedrig abundanten Proteinen zu ermöglichen, ist die Erhöhung der Trennleistung ein besonders wichtiger Aspekt für unsere Studien.

Massenspektometrie

Für die moderne Proteomanalytik ist die Trennung von komplexen Peptidgemischen essentiell. Im Rahmen unserer Projekte erfolgt die Analyse durch die Kombination von hocheffizienter Probenauftrennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) und massenspektrometrischer Detektion. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein Verfahren mit dem das Verhältnis von Masse zu Ladung eines Ions (m/z) bestimmt wird. Dabei ist das Grundprinzip an allen MS Geräten gleich: Ionenerzeugung, Ionentrennung und Ionennachweis. Die Erzeugung der Ionen ist abhängig von der verwendeten Ionenquelle. Die in der Proteomanalytik am häufigsten verwendeten Methoden sind die Elektrospray-Ionisation (ESI) und die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI). Bei der ESI-MS werden Proteine/Peptide am Ende einer Kapillare, an der eine Spannung anliegt, versprüht. Die entstehenden Ionen gehen bei diesem Prozess aus der Lösung in die Gasphase über (Desolvatisierung). Die Ionenerzeugung beim MALDI basiert auf der Co-Kristallisation der Analyten mit einer Matrix. Durch Laserbeschuss werden die Matrixmoleküle angeregt. Dabei überträgt die Matrix die Energie auf die im Kristall eingebauten Analytmoleküle, die dadurch desorbiert und ionisiert werden. Zudem erfolgt eine Protonierung der Analyten durch die Matrixmoleküle. Nach der Ionenerzeugung werden die Ionen durch elektrische Linsen fokussiert und gelangen in den Analysator. Es können verschiedenste Massenanalysatoren verwendet werden wie z.B. Quadrupol, Flugzeit (time-of-flight) oder Ionenfallen. Häufig werden zwei gleiche oder unterschiedliche (Hybrid-System) Analysatoren kombiniert. Am Ende werden die zuvor separierten Ionen mit dem Detektor erfasst. Neben der m/z Bestimmung werden in der Proteomik auch Sequenzanalysen von Peptiden mittels MS durchgeführt. Dazu werden sogenannte MS/MS Experimente verwendet in denen ein Peptid in einem ersten MS Scan definiert/ausgesucht wird. Anschließend erfolgt die Fragmentierung dieses Peptids in einer Kollisionszelle. Dabei brechen die Peptidbindungen und es werden Fragmentionen generiert die in einem zweiten MS Scan detektiert werden. Die Information der Fragmentionen dient als Grundlage zur Sequenzbestimmung des Ausgangs-Peptids, da die Abstände aufeinander folgender Fragmentionen der Masse einer Aminosäure entsprechen.
In der Proteomik findet die Massenspektrometrie Einsatz bei der Identifizierung, Charakterisierung sowie Quantifizierung von Proteinen und Peptiden aus komplexen Proben.


MALDI-Imaging

MALDI Imaging (MALDI-MSI) hat sich in den letzten Jahren zu einer etablierter Methode im Kontext von Biomarker- und Targetidentifizierung entwickelt. Die Besonderheit des MALDI-MSI als massenspektrometrische Technik, ist die Eigenschaft, dass neben Massendaten gleichzeitig die histologischen Informationen erhalten bleiben. Die Informationen über die räumliche Verteilung von Peptidmassen kann helfen Tumorgewebe von gesundem Gewebe zu differenzieren.

Eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (1D-PAGE)

Einfache erste Trennungen von komplexen Proteingemischen vor massenspektrometrischen Analysen oder einem Western Blot werden normalerweise mit der 1D-PAGE durchgeführt. Die 1D-PAGE nach Lämmli, mit Natriumdodecylsulfat (SDS) als negativ geladenes Detergens (7), wird allgemein für die Trennung von Proteinen genutzt, entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität. Durch Bindung an SDS besitzen die denaturierten Proteine eine identische Anzahl von Ladungen pro Proteinmasse, was nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes zur Trennung entsprechend der Größe der Proteine führt. Anschließend können die Proteine mit verschiedenen Färbemethoden (z.B. der Silberfärbung oder der Coomassie-Färbung) sichtbar gemacht werden.

Zwei-Dimensionale Proteintrennung: klassische 2D-PAGE

Die 2D-Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) wurde vor 30 Jahren unabhängig voneinander von Klose und O’Farrell entwickelt [5,6]. Bei der Methode handelt es sich um die Kombination von zwei orthogonalen Trenntechniken. In der ersten Dimension erfolgt die Auftrennung der Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (isoelektrische Fokussierung) und anschließend in der zweiten Dimension nach ihrer elektrophoretischen Mobilität.

Im Falle der isoelektrischen Fokussierung werden zwei Techniken unterschieden, das auf Carrierampholyten basierende System (CA-basierte IEF) [5,6] und zum anderen das immobilisierte pH-Gradient (IPG) System [7,8]. Beim CA-basierenden System wird der pH-Gradient während der Fokussierung durch Trägerampholyte aufgebaut. Die Proteine wandern im elektrischen Feld bis zu dem Punkt, an dem ihre Nettoladung Null entspricht (isoelektrischer Punkt). Das IPG System ist weiter verbreitet, da es käuflich erwerblich ist. Bei diesem System ist der pH-Gradient ins Gel mittels verschiedener, puffernder Acrylamidderivate einpolymerisiert. Der pH-Gradient ist dadurch sehr stabil. In der zweiten Dimension findet eine Trennung nach ihrer elektrophoretischen Mobilität meistens durch konventionelle SDS-PAGE statt [9].

Zwei-Dimensionale Proteintrennung: 2D-DIGE

Die Einführung von fluoreszierenden Reagenzien zur Proteinmarkierung (difference-in-gel-electrophoresis oder DIGE) hat zu einer wesentlichen Verbesserung im Bereich der 2D-PAGE beigetragen. Es bietet den Vorteil, bis zu drei Proben in einem Gel zu multiplexen, einer höheren Sensitivität im Vergleich zu herkömmlichen Proteinfärbemethoden sowie einen höheren linearen Quantifizierungsbereich.

Laser Capture Microdissection

Die Laser capture microdissection (LCM) oder Laser-Mikrodissektion (LMD), ermöglicht eine Isolation definierter einzelner Zellen oder Zellcluster [10]. Bei diesem Ansatz werden Gewebeschnitte auf Objektträgern unter dem Mikroskop visualisiert. Zellen oder Regionen können anschließend durch einen Laser ausgeschnitten und in einem Gefäß gesammelt werden um zum Schluss DNA, RNA und Proteine, welche für die Subpopulation charakteristisch sind, durch PCR, Western Blot oder Massenspektrometrie zu analysieren [11].

Protein-Mikroarrays und Peptid-Mikroarrays

Protein-Mikroarrays und Peptid-Mikroarrays gehören zu den führenden Hochdurchsatzverfahren zum Nachweis von Biomarkern und der Entwicklung neuer Arzneimittel. Sie können mehr als 20.000 Moleküle (Proteine, z.B. Antikörper, Peptide, etc.) beinhalten, weshalb sie die Verarbeitung einer Vielzahl von Proben in kurzer Zeit ermöglichen. Das Grundprinzip von Protein-Mikroarrays besteht in der Inkubation mit einer Probenlösung, die potentiell interagierende Proteine/ Peptide enthält. Hierbei können bereits identifizierte interagierende Proteine mithilfe markierter Antikörper nachgewiesen werden. Wenn jedoch neue Interaktionspartner nachgewiesen wurden, sind zusätzliche analytische Werkzeuge nötig, z.B. die Massenspektrometrie.

Antigen-Antikörper Interaktionen sind bei verschiedenen autoimmunen und progressiven Erkrankungen von besonderem Interesse. Um mehr über die Umstände von Bindungen zu erfahren, besteht die Möglichkeit Protein-Protein und Protein-Peptid Interaktionen zu untersuchen, welche einen wichtigen Schwerpunkt in Studien zur Progression von Erkrankungen und der Identifikation neuer Signalwege darstellen. Darüber hinaus können Peptid-Arrays auch für die Identifikation von Epitopen eines Proteins genutzt werden, was sehr vorteilhaft für die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Therapien ist.

Luminex®

Die Luminex®-Technologie ist ein “flüssiges Microarray-System”, welches die simultane Analyse von über 100 verschiedenen Molekülen in einem Well einer Mikrotiterplatte erlaubt. Von besonderem Interesse ist Luminex® für das Screening einer definierten Biomolekülgruppe an größeren Kohorten.

Aminosäure-Analyse

Das Verfahren der Aminosäureanalyse (AAA) erlaubt die Konzentrationsbestimmung von Aminosäuren in einer definierten Probe, womit auf die Konzentration von Proteinen oder Peptiden geschlossen werden kann. Die AAA wird in drei Schritte unterteilt: Zu Beginn werden die Proben chemisch hydrolysiert. Der zweite Schritt besteht in der Derivatisierung der einzelnen Aminosäuren mit einem Fluorophor. Zum Schluss erfolgt die Trennung der fluoreszenzmarkierten Aminosäuren mittels reversed-phase HPLC. Die quantitative Analyse wird außerdem mit einem “internen Standard” zur Qualitätssicherung durchgeführt.

Zellkultur

Die Zellkultur bezeichnet seit den Fünfziger Jahren eine Reihe von Techniken und Anwendungen zur Haltung und Manipulation höherer eukaryontischer Zellen aus Tier und Mensch. Für die Grundlagenforschung und Entwicklung ist die Zellkultur ein leicht zugängliches System, um konkrete Aufschlüsse über Stoffwechsel, Signaltransduktion sowie Protein- und Genexpression zu gewinnen.

Während in der sog. Primären Zellkultur Einzelzellen, z.B. embryonale Stammzellen oder ganze Gewebe aus lebenden Organismen entnommen werden, stehen hier in der sekundären Zellkultur unsterbliche Hybridoma- bzw. Tumorzelllinien mit spezifischen Eigenschaften fast unbegrenzt zur Verfügung. Insbesondere als valides Modellsystem für den Menschen lassen sich so die Wirkungsweise und Toxizität von Testsubstanzen abbilden.

Allen Arbeitsweisen ist die aseptische Haltung unter definierten Bedingungen gemeinsam (als Suspensionskultur oder adhärent im Nährmedium wachsend), wobei nicht nur Beeinflussung von Wachstum und Entwicklung durch Zusätze wie Cytokine und Pharmaka, sondern auch gezielte Veränderung des Genoms und der Proteinexpression durch Transfektion mit Plasmiden und interferierender RNA möglich sind.

Diese Anwendungen bieten den großen Vorteil von hoher Reproduzierbarkeit bei relativ geringem Aufwand und sind beliebig skalierbar, von Mikrotiterplatten mit wenigen Zellen bis auf mehrere hundert Gramm Zellmasse für Proteinlysate und Gewinnung niedrig abundanter Proteine. Zahlreiche Zelllinien aus Mensch und Tier stehen uns zur Wahl, um individuell den Anforderungen des Experimentators zu genügen (z.B. HEK293T, SH-SY5Y, HMV-II, SHEP-SF, KCN, U373, COS, HeLa, siehe auch ECACC). Unser Augenmerk liegt hierbei auf den Repräsentanten des Nervensystems.

Molekularbiologie

Die Molekularbiologe ist die Basis für sämtliche Arbeiten mit RNA und DNA, für deren Analyse und Manipulation in Pro- und Eukaryonten. Sie untersucht das biologische System auf zellulärer Ebene, wobei unser Augenmerk auf der resultierenden Proteinbiosynthese liegt.

Design und Klonierung gewünschter DNA-Sequenzen zur induzierten Überexpression oder Unterdrückung von Proteinen, Untersuchungen zur Genfunktion, gehen diversen Anwendungen z.B. in der Zellkultur voraus. Es werden dadurch sog. gain-of-function- oder loss-of-function-Experimente möglich. Auf diese Weise lassen sich die Entstehung, Funktion und Regulation von Proteinen und ihren RNA-Vorläufern schrittweise nachvollziehen, beispielsweise die des Amyloid Precursor-Proteins oder des Neuromelanins.
Die Resultate werden standardmäßig durch spezielle PCR-Anwendungen und Blott-Techniken verifiziert und quantifiziert (z.B. real time quantitative PCR oder cDNA-Synthese, DNA/RNA-Gelelektrophorese und Southern/Northern Blot). So sind unabhängige Nachweismethoden verfügbar und es ergeben sich fließende Übergänge zur Biochemie und Proteinanalytik.

Bioinformatik/Biostatistik

Als Arbeitsgruppe Bioinformatik / Biostatistik des Medizinischen Proteom-Centers stellen wir unsere eigenentwickelten Proteomik-Software-Tools für Anwender mit verschiedenen Bioinformatik- und IT-Kenntnissen zur Verfügung. Des Weiteren bringen wir in Kooperationen unsere Kompetenz bzgl. der Standardisierung und Konvertierung von Datensätzen und Ergebnislisten ein, die in öffentlichen Daten-Repositories abgelegt oder bei wissenschaftlichen Fachzeitschriften eingereicht werden sollen. Außerdem bieten wir unseren Kooperationspartnern unsere Fachkompetenz bzgl. der Analyse von Proteomikdaten sowie unsere Hardware an, sodass Wissenschaftler ihre statistischen und computergestützten Analysen von proteomischen Datensätzen mit unseren Software-Tools und/oder mit anderweitig entwickelter Proteomik-Software durchführen können.

Proteomik-Software Tools:
•    Proteomics Conversion Tool (ProCon): Datenformatkonvertierung für Proteomikdaten
•    Unique Peptide Finder (UPF): Bestimmung uniquer Peptide in Proteindatenbanken
•    Protein List Comparator (ProLiC): Vergleich von Proteinlisten unter Berücksichtigung der Proteinsequenzen oder Informationen über die gemessenen Peptidsätze
•    Protein Array Analyzer (PAA): R-Paket für die Biomarkerdetektion mit Protein-Microarrays
•    FindPairs-Modul aus dem PeakQuant Software Paket: Automatische Bestimmung von Proteinmengenverhältnissen und Eigenschaftskennzahlen für 14N/15N-Labelling-, SILAC-, und iTRAQ-Daten
•    Statistical DIGE Analyzer (SDA): Datenverarbeitung und Analysen für DIGE-Experimente
•    Protein Inference Algorithms (PIA): Proteininferenz (bei Protein-Ambiguities in der Bottom-Up-Proteomik), wobei verschiedene Suchmaschinen und Proteininferenzalgorithmen unterstützt werden
•    CrossPlatformCommander (XPlatCom): Datenkonvertierung, Qualitätskontrolle, Datenvergleiche, Text Mining und statistische Analysen für multi-omics Workflows
•    BALLtools: Kommandozeilenwerkzeuge für strukturelles Alignment, Modifikation und simulierte Faltung dreidimensionaler Moleküle.

Datenstandardisierung und -konvertierung:

Wir stellen unsere Fachkompetenz bzgl. der proteomikspezifischen und XML-basierten Datenstandards und Ontologien zur Verfügung:
•    Vorbereitung der Daten für Veröffentlichungen in wissenschaftlichen Fachzeitschriften unter Berücksichtigung zeitschriftenspezifischer Vorgaben
•    Datenkonvertierung
•    Ablage von Daten in öffentliche Repositories
•    Pflege von Controlled Vocabularies als Dienstleistung für die wissenschaftliche Community

Computergestützte und statistische Analyse von Proteomik-Daten als Kooperation:
•    Bioinformatische Analyse Proteomik-Daten
•    „Hardware Sharing“ (High-Performance Compute Cluster, Virtuelle Server, GPU array und Intel Xeon Phi Cluster)
•    Statistische Analyse von High-Throughput-Daten

Referenzen:

1. May C, Brosseron F, Chartowski P, Schumbrutzki C, Schoenebeck B, et al. (2011) Instruments and methods in proteomics. Methods Mol Biol 696: 3-26.

2. Marcus K, Joppich C, May C, Pfeiffer K, Sitek B, et al. (2009) High-resolution 2DE. Methods Mol Biol 519: 221-240.

3. May C, Brosseron F, Chartowski P, Meyer HE, Marcus K (2012) Differential proteome analysis using 2D-DIGE. Methods Mol Biol 893: 75-82.

4. May C, Brosseron F, Pfeiffer K, Meyer HE, Marcus K (2012) Proteome analysis with classical 2D-PAGE. Methods Mol Biol 893: 37-46.

5. O'Farrell PH (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250: 4007-4021.

6. Klose J (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26: 231-243.

7. Gorg A, Postel W, Gunther S (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9: 531-546.

8. Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG, Gianazza E, Gorg A, et al. (1982) Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods 6: 317-339.

9. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

10. Murray GI (2007) An overview of laser microdissection technologies. Acta Histochem 109: 171-176.

11. Decarlo K, Emley A, Dadzie OE, Mahalingam M (2011) Laser capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755: 1-15.

12. Abel L, Kutschki S, Turewicz M, Eisenacher M, Stoutjesdijk J, et al. (2014) Autoimmune profiling with protein microarrays in clinical applications. Biochim Biophys Acta.

13. May C, Nordhoff E, Casjens S, Turewicz M, Eisenacher M, et al. (2014) Highly Immunoreactive IgG Antibodies Directed against a Set of Twenty Human Proteins in the Sera of Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis Identified by Protein Array. PLoS One 9: e89596.