RUB »Aktuelle Seite

Forschung

Das besondere Interesse unserer Arbeitsgruppe dient der Aufklärung von komplexen Protein-and Peptidgemischen. Unsere Fragestellungen kommen interdisziplinär aus Biologie, Medizin und Chemie, um biologischen Reaktionsmechanismen aufzuklären. Hierbei arbeiten wir verstärkt auch an der Weiterentwicklung von neuen Technologien für die Proteomforschung. Im Gegensatz zur zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) nutzen wir die gelfreie MudPIT Technologie (Multidimensionale Protein Identifikationstechnologie). Bei dieser Technologie werden die Proteine vor einer Trennung verdaut. Das Herzstück dieser Technologie ist eine fused silica Kapillarsäule, die zuerst mit einem reversed phase Material gepackt wird und anschließend mit einem starken Kationenaustauscher. Die Peptide werden dann zuerst auf den starken Kationenaustauscher geladen und mittels ansteigenden Salzstufengradienten in Zyklen eluiert. Jeder Zyklus besteht dabei aus einem Salzstufen- und einem Reversed phase-Gradienten. Je nach Komplexizität der Probe werden 10-15 Salzstufen verwendet um alle Peptide von der zweidimensionalen Säule zu waschen. Die Peptide werden dann dem Massenspektrometer zugeführt, in dem durch Stöße mit Edelgasatomen Peptidfragmentionen in einem Tandem Massenspektrum aufgezeichnet werden. Der SEQUEST Algorithmus vergleicht die gemessen Spektren mit theoretischen Spektren von Peptidsequenzen in einer Datenbank. Typischerweise werden eine sehr große Anzahl von ca. 30000-50000 Tandem Massenspektren innerhalb von 24h generiert, die durch leistungsstarke Rechner prozessiert werden. Bis zu 1500 verschiedene Proteine können so innerhalb von 24 h identifiziert werden. Die MudPIT Technologie hat sich als äußerst leistungsstarke high-throughput Technologie insbesondere zum Shotgun Approach von gesamten Proteomen erwiesen, die ´low abundance´ und hydrophobe Proteine, wie z.B. Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren und integrale Membranproteine zugänglich macht. Darüber hinaus eignet sich MudPIT sehr gut zur Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen. Gemeinsam mit der zweidimensionalen Gelektrophorese wird sich die MudPIT Technologie hoffentlich zu einem leistungsstarken Werkzeug in der Proteinanalytik etablieren, bedingt durch einen großen dynamischen Bereich (10000:1), ausgezeichnete Peakkapazität (23000), guter Reproduzierbarkeit (0,5%) und einfacher und vollautomatischer Analyse bei geringen Kosten.