Kalorimetrie

Die Kalorimetrie ist eine sehr vielseitig einsetzbare Methode, da sie keine besonderen Markierungen oder Immobilisierungen der zu untersuchenden Proteine erfordert, sondern die auftretende Wärmetönung der betreffenden Interaktion direkt zur Detektion nutzt. Konventionelle Geräte sind heutzutage so empfindlich, dass auch verdünnte Proteinlösungen untersucht werden können, vor allem aber dass dadurch hoch affine Wechselwirkungen thermodynamisch beschrieben werden können.

Messmethoden

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

Mit Hilfe der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) ist es möglich, neben den Änderungen der freien Reaktionsenthalpie (Δ G°) und der Enthalpie ( Δ H°) auch die der Entropie ( Δ S°) und der Wärmekapazität ( Δ Cp°) zu erhalten. Diese umfassenden Daten über Protein-Protein Interaktionen helfen den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der Proteine zu erkennen und die Interaktionsweise von Biomolekülen zu verstehen. In der Jubiläumsausgabe von BIOspektrum (1/2005) haben wir diese Methode und ihre Anwendung auf Protein-Interaktionen näher beschrieben.


Diese Abbildung zeigt das von uns verwendete Auto-iTC200 der Firma MicroCal. Der Roboterarm, der die schrittweise, computergesteuerte Vermischung der beiden Proteine bewerkstelligt sowie die eigentliche Messeinheit befinden sich im Innern des Schranks. Im unteren Teil des Schranks befindet sich eine gekühlte Schublade für 96-Well Platten, so daß mit diesem Gerät vollautomatisch mehrere Experimente hintereinander durchgeführt werden können. Die Auswertung der Experimente (wie unten dargestellt) erfolgt dann am Computer.
Nach jeder Injektion einer kleinen Menge des Proteins A zum Protein B in der Messzelle eines ITC ist eine entsprechende Änderung der Heizleistung zu erkennen (hier negative Peaks - also exotherme Interaktion).
Unten: Die Auswertung der Daten durch Auftragung der Reaktionsenthalpie (integrierte Daten von oben) gegen das zunehmende Verhältnis der Konzentrationen von Protein A und B erlaubt eine vollständige, thermodynamische Beschreibung der Interaktion.


Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Differential Scanning Calorimetry (VP-DSC from MicroCal) is frequently used in our group, to study protein thermal stability and the thermodynamics characterizing its unfolding and/or refolding. The apparatus measures the temperature difference between a reference cell (containing buffer/solvent) and a sample cell, which is then calibrated to the power units (DP signal or the differential power between the two cells). Generally, an endothermic process (such as protein unfolding or dissociation) in the cell causes the DP signal to deflect in the positive direction, while an exothermic event (such as protein association/aggregation) gives a negative response. The temperature range that can be used is -10 to 130 °C and, for scanning solutions above their boiling point, the VP-DSC has a self-contained pressurizing system allowing positive pressures between 0 to 30 p.s.i. For complete quantitative thermodynamic analysis, accurate protein concentrations are required and also different parameters, such as scan-rate, pH, concentration, buffer etc should be varied. Beside general protein unfolding-refolding characteristics, other processes, e.i. the effect of protein-protein or protein-ligand interactions, co-solvents or molecular crowding on the thermal transitions are currently investigated and thermodynamic models are derived. The experimental data are coupled with the structural thermodynamics information and details of the proteins structural organization and changes are deduced. VP-DSC can also be used to investigate other biological molecules, such as membranes, lipids or nucleic acids, as well as more complicated complexes, like lipid-protein or nucleic acid-protein interactions.