Vergleich des Allergens Phl p 5b (C-Terminus) und seiner hypoallergenen Mutante im murinen Allergiemodell
Phl p 5b ist ein Majorallergen aus dem Lieschgras (Phleum pratense), das von 80 % der Gräser-Pollen-Allergiker erkannt wird. In der C-terminalen Hälfte sind 12 Lysine enthalten, von denen 10 an der Oberfläche des Moleküls lokalisiert sind. Diese Oberflächen-Lysine sind für die IgE-Bindung von großer Bedeutung, wie Gehlhar et al. durch den Vergleich mit der Lysin-defizienten Mutante Mut c zeigen konnten.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Oberflächen-Lysine im Phl p 5b C-Terminus auf die Antikörper-Induktuion untersucht werden. Dazu wurde ein murines Allergie-Modell für die Immunisierung mit dem Phl p 5b-Wildtyp-Protein und der Mutante Mut c etabliert.
Bei der Induktion von IgE- und IgG1-Antikörpern durch das WT-Protein und die Mutante wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Auch die Zytokin-Produktion durch mit WT-Protein bzw. Mutante restimulierte Milzzellen sowie die Zusammensetzung der Zelltypen in der broncho-alveolären Lavage-Flüssigkeit zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Art der Immunantwort gegen die beiden Allergen-Varianten auf.
Anhand von ELISA-Inhibitionstests wurde festgestellt, dass die Affinität der gegen das Phl p 5b WT-Protein gebildeten IgG1-Antikörper höher war als die Affinität der gegen die Mutante gerichteten IgG1-Antikörper.
Die zur Immunisierung eingesetzten Allergen-Varianten wurden rekombinant in E. coli überexprimiert. Dadurch kam eine Verunreinigung der Protein-Lösungen mit LPS zustande, die bei der Mutante deutlich höher war als beim WT-Protein. Eine weitere Aufarbeitung der Proteine über EndoTrap-Säulen konnte zwar die Unterschiede im LPS-Gehalt nicht beseitigen, aber die Kontamination um ca. 80 % reduzieren.
Die Ergebnisse der zweiten Immunisierung mit den geringer kontaminierten Proteinen unterschieden sich von denen der ersten Immunisierung, bei der die stärker mit LPS-verunreinigten Proteine verwendet wurden: LPS schien einen protektiven Effekt ausgeübt zu haben, da die Antikörpertiter bei den Tieren der zweiten Immunisierung höher waren und die Infiltration eosinophiler Granulozyten in die Lunge stärker ausgeprägt war. Es traten jedoch wiederum keine signifikanten Unterschiede zwischen den WT- und den Mut c-behandelten Tieren auf und auch die Affinitäts-Unterschiede zwischen den gegen das WT-Protein und die Mutante gebildeten IgG1-Antikörpern wurden bestätigt. Die Oberflächen-Lysine scheinen daher weniger für die Induktion von Antikörpern, sondern vielmehr für die Affinität der gebildeten Antikörper von Bedeutung zu sein.