Protektion durch Probiotika (Nissle)
Die Untersuchung befasst sich mit der in vitro Analyse der probiotischen Wirkung bakterieller Komponenten auf humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMZ). Dabei steht im experimentellen Fokus der Vergleich verschiedener Lipopolysaccharide (LPS) und bakterieller Lysate eines probiotisch aktiven Bakteriums mit dem korrespondierenden nicht-probiotischen Wildtypstamm. Als Read-out System wird unter anderem die Methodik der Mikroarray Technologie eingesetzt. Dieser Ansatz ermöglicht ein umfangreiches Screening und Aufnahme eines breiten Genexpressionsmuster in PBMZ nach Stimulation mit bakteriellen Bestandteilen. Der Vergleich der Genexpressionsmuster in PBMZ nach Stimulation mit Komponenten eines probiotisch aktiven und eines probiotisch inaktiven Bakterienstamm soll Hinweise auf molekulare Wirkmechanismen geben, die eine günstige Beeinflussung immunologischer Dysregulationen durch Probiotika erklären.
| Methodik |
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Zellkulturen aus humane PBMZ gesunder Spender werden mit hochaufgereinigten LPS- Präparationen oder bakteriellen Rohlysaten stimuliert. Am Ende der Inkubationszeit wird die zelluläre mRNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und dabei mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 oder Cy5 markiert. Die so Cy3-markierte cDNA einer stimulierten Probe wird kompetetiv mit Cy5-markierter cDNA aus unstimulierten PBMZ auf Oligonukleotid Mikroarrays hybridisiert. Die Hybridisierungssignale an den ca. 10000 gespotteten humanen Gensequenzen werden über einen Axon-Scanner ausgelesen. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten einzelner Spots geben Auskunft über die Stärke der Transkriptionsrate einzelner Gene. Zudem enthält das Signalintensitätsverhältnis zwischen Cy3 und Cy5 innerhalb eines Spots die Information über eine stimulusabhängige Induktion oder Repression der Genexpression.
Ausschnitt eines typischen Fluoreszenzbildes nach Hybridisierung von Cy3/Cy5 markierter cDNA
Gesamtauswertung (Scatterplot Analyse) eines hybridisierten 10 K human Arrays. Gegeneinander aufgetragen sind die Fluoreszenzintensitäten des Cy3 und Cy5 Kanals.