Quantitative real-time PCR auf dem StepOne Sequence Detektion System
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Dr. rer. nat. Karin Peters
Bei der konventionellen PCR-Technik ist eine gelelektrophoretische Analyse der synthetisierten PCR-Produkte erst nach Ablauf der gesamten PCR möglich. Bei dieser Endpunktbestimmung korreliert die Menge an entstandenem PCR-Produkt nicht mit der initial eingesetzten Menge an Matrizen-DNS. Zuverlässige quantitative Aussagen lassen sich nur treffen, wenn man den Verlauf der Amplifikationskurven kennt. Die real-time PCR-Methodik ermöglicht die Messung der Amplifikatzunahme während jedes einzelnen PCR-Zykluses durch die Aufzeichnung einer mit der PCR-Produktmenge korrelierten Fluoreszenzzunahme. Bei der TaqMan-Technologie enthält der PCR-Reaktionsansatz neben dem Primerpaar eine Oligonukleotidsonde, die sequenzspezifisch innerhalb des Amplikons bindet. Diese Sonde ist an ihrem 5'-Ende mit einem Reporter-Farbstoff und an ihrem 3'-Ende mit einem Quencher-Molekül gekoppelt. Bei einer intakten Sonde wird die Abstrahlung einer Emmisionsfluoreszenz vom Reportermolekül auf Grund der räumlichen Nähe durch den Quencher verhindert (FRET Mechanismus). Im Zuge der Elongation der 3'-Enden der Primer trifft die Taq-Polymerase auf die angelagerte Sonde. Über die Exonukleaseaktivität hydrolysiert die Taq-Polymerase die Sonde vom 5'-Ende her und setzt somit das Quencher und Reporter-Molekül frei. Dies hat zur Folge, dass es während der PCR-Reaktion so zu einer Amplifikat-abhängigen Zunahme der Fluoreszenzintensitäten kommt. Die Fluoreszenzen werden für jeden Ansatz einzeln durch eine optische Detektionseinheit über den gesamten PCR-Lauf hinweg aufgezeichnet und Computer-gestützt ausgewertet.
Einsatz in der Abteilung: |
| Quantifizierung von Expressionsniveaus verschiedenster Gene Nachweis von diversen Viren und Quantifizierung der viralen Last |
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| Die Abbildung zeigt unseren StepOne real-time PCR Thermozykler |
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| Darstellung der Strahlengänge in der Detektionseinheit für das Exitationslicht und die aus den PCR-Reaktionen abgestrahlten Fluoreszenzen. |
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| Typischer Verlauf von real-time PCR Amplifikationskurven nach Auswertung und Darstellung durch die Geneamp SDS Software. |