Beschreibung der Module


Modul 1: Tool-Box für biotechnologisch relevante Pilze

Herstellung transgener Stämme durch die gezielte Zerstörung von Ziel-Genen

Ein Problem bei der Herstellung transgener Pilzstämme ist die ektopische (zufällige) Integration der transformierten DNA in das Genom. Diese ektopische Insertion wird durch Rekombinations-Proteine, z. B. Ku70, geleistet, die für das „non-homologous end-joining (NHEJ)“ verantwortlich sind. Durch die Zerstörung des Ku70 Gens wird die nicht-homologe Rekombination unterdrückt, statt dessen jedoch die homologe Rekombination gefördert.
Fazit: Herstellung von Rezipienten-Stämmen, bei denen der gezielte Genaustausch effizient möglich ist.

Ziel:
Gerichteter Genaustausch zur geplanten Stammoptimierung

Problem:
Erbinformation inseriert zufällig im Pilzchromosom

Lösung:
Inaktivierung von "Insertionsproteinen", z. B. Ku70


Recycelbare Markergene unter Verwendung des Hefe-Rekombinase-Systems

Bei der genetischen Manipulation von Pilzstämmen werden in der Regel heterologe Selektionsmarker eingesetzt. Für Produktionsprozesse ist es jedoch vorteilhaft, wenn Stämme ohne heterologe Selektionsmarker verwendet werden. In diesem Projekt werden deshalb Verfahren entwickelt, um Fremdgene aus pilzlichen Produktionsstämmen zu entfernen.
Die Flipper (FLP)-Rekombinase von Saccaromyces cerevisiae ist eine Sequenz-spezifische Rekombinase, die bereits in Bakterien- und Säugerzellen erfolgreich eingesetzt wurde, um in vivo-Rekombinationen zu erzielen. Die Rekombinase besteht aus einer einzigen Untereinheit und erkennt spezifisch eine 28 bp-lange Erkennungssequenz (FLP recognition target = FRT). In dem hier vorgestellten Projekt wird das FLP-Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren pilzlichen Promotors gestellt. Sobald das FLP-Gen in dem pilzlichen Wirtsstamm exprimiert wird, kommt es zur Rekombination von benachbarten FRT-Sequenzen. Dies führt zum Herausschneiden solcher DNA-Sequenzen, die zwischen den FRT-Sequenzen gelegen sind. Das Resultat ist ein Marker-freier Pilzstamm.

Beispiel:
FLP-Rekombinase (Marker release)

Projektziel:
Entfernung fremder Markergene aus Produktionsstämmen


Modul 2: Neue regulatorische Faktoren des Sekundärmetabolismus und der Zellmorphologie

Strategie zur Isolation von DNA-Bindeproteinen, die als regulatorische Faktoren auf die Expression von Biosynthese-Genen wirken

Wesentliche Experimentalschritte:

1. Chromatographie-Verfahren
2. Massenspektrometrische Analyse der Proteine
3. Biochemische Charakterisierung der Proteine
4. Analyse von transgenen Pilzstämmen
5. Analytik von Sekundärmetabolismus und Morphologie
6. Biotechnologische Umsetzung

Projektziel:
Identifizierung spezifischer Faktoren, welche auf den Sekundärmetabolismus und die Morphologie wirken.





Transposon-Mutagenese

Die Transposon-Mutagenese wird genutzt, um genetisch veränderte Pilzstämme bei gleichzeitiger Gen-Identifizierung zu erhalten. Das System besteht aus folgenden Komponenten:


1. Vektorsystem zur Expression eines Transposase-Gens
2. Defekte Transposonen mit Sequenzen für die Aktivierung duch die Transposase
3. System zur Expression des Transposase-Gens
4. System zur Identifizierung von Pilzstämmen mit zerstörtem Ziel-Gen
5. Verfahren zur Charakterisierung mutierter Pilzstämme

Projektziel:
Gezielte Herstellung genetisch veränderter Stämme


Christian Doppler Forschungsgesellschaft
  • Modul 1:
    Tool-Box für biotechnologisch relevante Pilze
  • Modul 2:
    Neue regulatorische Faktoren des Sekundärmetabolismus und der Zellmorphologie