Schwerpunkte

Schwerpunkte der Forschungstätigkeiten

Die Forschungsschwerpunkte am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik sind dem Bereich der molekularen Botanik zuzurechnen. Als Versuchsorganismen werden im wesentlichen eukaryontische Mikroorganismen eingesetzt. Dazu zählen sowohl einzellige und thallöse Algen als auch Hefen und Hyphenpilze. Die Arbeitstechniken sind folgenden Bereichen zuzuordnen: molekulare und klassische Genetik, Biochemie, Molekularbiologie, Cytologie und Morphologie, Biotechnologie.

Im einzelnen werden die folgenden Projekte bearbeitet:

Biogenese von Organellen photoautotropher Organismen

Die Kontrolle der RNA-Prozessierung durch Spleißfaktoren

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein geeigneter eukaryotischer Modellorganismus zur Analyse der nukleären und plastidären Komponenten, die in der Kontrolle der RNA-Prozessierung durch Spleißfaktoren eine Rolle spielen. Die notwendigen Regulationsmechanismen werden dabei überwiegend auf posttranskriptioneller Ebene durch kernkodierte RNA-bindende Faktoren verwirklicht.
Ein eindrucksvolles Beispiel für die Abhängigkeit der plastidären Genexpression von kernkodierten Faktoren ist die Expression des psaA-Gens im Chloroplasten von C. reinhardtii, welche in diesem Projekt molekulargenetisch und biochemisch analysiert wird. Dieser Prozess ist deshalb besonders geeignet, weil die reife mRNA durch trans-Spleißen verschiedener Primärtranskripte unter Beteiligung von mindestens 14 nukleär und mehreren plastidär kodierten Faktoren gebildet wird (Abb. 1). In diesem Zusammenhang sei betont, dass es sich bei den gespleißten Intronen zwar um sogenannte Gruppe II-Intronen handelt, also Intronen mit autokatalytischen Eigenschaften, dass für den Maturierungsprozess aber offensichtlich ebenfalls zusätzlich Proteine notwendig sind. Es wird postuliert, dass die beteiligten RNA-Moleküle und Proteine Komponenten eines Ribonukleoprotein-Partikels (RNP) sind, der möglicherweise einem "plastidären Spleißosom" entspricht.

Es existiert bereits eine Vielzahl von nukleären trans-Spleißmutanten, die sich anhand ihrer Spleißdefekte in drei verschiedene Klassen einteilen lassen und deren Genprodukte möglicherweise Komponenten dieses RNPs darstellen. Ein Schwerpunkt des Projektes besteht darin, in einem vorwärtsgerichteten genetischen Ansatz solche Mutanten durch Transformation mit einer Cosmid-Genbank funktionell zu komplementieren, um nach Subklonierung der entsprechenden Bereiche die Genloci für Spleißfaktoren zu identifizieren. Weiterhin sollen Mutanten aus allen drei Mutantenklassen durch umfassende Membran-Array-Experimente bezüglich ihrer Transkriptome untersucht werden, um so Mutanten-spezifische und Mutantenklasse-spezifische Transkriptänderungen zu erkennen.
Ein anderer Ansatz zur Charakterisierung von Gruppe II-Intron-spezifischen RNA-bindenden Proteinen beruht auf biochemischen Verfahren. Mit Hilfe von Sedimentationsanalysen konnten beispielsweise relativ große Intron-haltige RNPs nachgewiesen werden. Durch Einsatz von plastidären Proteinextrakten in in vitro-Bindungsexperimenten (UV-Quervernetzungsexperimente) wurden zwei Proteine identifiziert, die spezifisch an Gruppe II-Intronen binden. Mittels der FPLC-Chromatographie konnten diese aus plastidären Proteinextrakten isoliert und mittels Q-TOF MS/MS identifiziert werden. Dabei greift man auf das komplett sequenzierte Chlamydomonas-Genom zurück. Zur in vivo Funktionsanalyse kommen ebenfalls RNAi-Techniken zum Einsatz.
Alternativ werden Komponenten des erwähnten putativen plastidären Spleißosoms mit Hilfe der Hefe-Hybrid-Systeme (Three-Hybrid) identifiziert. Die spezifische Interaktion eines dieser isolierten Proteine mit Gruppe II-Intron RNA wurde in vivo in Gelretentionsanalysen untersucht (Abb. 2). Um die plastidäre Lokalisation solch RNA-bindender Proteine zu zeigen, kommt die Konfokale Laser Scanning Mikroskopie zum Einsatz. Für die Identifizierung neuer Komponenten werden die isolierten Proteine bezüglich weiterer Protein-Protein-Interaktionen analysiert (Two-Hybrid, Ko-Immunopräzipitation).

In unserem Projekt sollen weiterhin durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation und Größenausschlusschromatographie die entsprechenden hochmolekularen Ribonukleoprotein-Komplexe nachgewiesen werden. Ziel ist es, unsere bereits charakterisierten Intron-RNA-Bindeproteine in diesen Komplexen zu identifizieren. Diese Arbeiten sollen durch RNA-Analysemethoden ergänzt werden, bei denen die Bindung plastidärer RNAs an diesen hochmolekularen Komplex nachgewiesen werden soll.


Abb. 1.

Schema zum trans-Spleißprozess des plastidären psaA-Gens. Die drei Exonen des psaA-Gens liegen auf dem Plastom verteilt vor und werden getrennt voneinander transkribiert und durch zwei trans-Spleißvorgänge zum maturen Transkript verknüpft. In rot gekennzeichnet sind bereits durch Mutanten-Analysen identifizierte Genprodukte


Abb. 2.

Gelretentionsanalysen und Kompetitionen zur Untersuchung der Spezifität der RNA-Bindung des cNAPL-Proteins. (a-d) cNAPL bindet an U-reiche plastidäre Transkripte. (e) Die Bindung ist unabhängig von der Gruppe II-Intron-Sekundärstruktur. (f) cNAPL bindet nicht an DNA.